SLFN11基因表达水平影响人肠癌细胞株对SN38的敏感性

【摘要】目的：结直肠癌(colorectalcancer,CRC)是种常见的发病率及死亡率较高的恶性肿瘤，化疗在其治疗手段中占有重要地位。CPT-11是CRC的主要治疗药物之，但是其疗效因耐药性的产生和毒性反应受到限制。目前尚未有明确的CPT-11疗效预测因子。因此找出CPT-11疗效预测因子，对于指导CRC患者个体化治疗，具有重要的意义。近两年体外研究发现SLFN11基因表达水平与CPT-11敏感性高度相关。SLFN11基因是SLFN（Schlafen）家族中人源性成员之。1998年，Schwarz等研究者发现SLFN家族基因SLFN1，参与调控胸腺发育。随后不断发现的SLFN家族其它成员的主要功能是调控细胞生长和分化。SLFN基因家族因为对细胞生长起重要的负调控作用，因此很可能是种潜在的抑癌基因。SLFN11在多种肿瘤细胞系中广泛表达，而且表达水平具有定的分布范围。在卵巢癌和CRC中，肿瘤组织的SLFN11分布明显大于周围的正常组织。研究者通过大规模肿瘤细胞系的转录组学分析，发现SLFN11基因高表达细胞对CPT-11的疗效好；但机制尚不明确。本研究旨在对人源性结直肠癌细胞系进行SLFN11基因功能与CPT-11的敏感性的相关研究。进步观察SLFN11基因表达对肠癌细胞系的CPT-11敏感性的影响，为探索CPT-11疗效预测分子提供科学依据。方法：（1）实时定量PCR、Westernblot法检测八种人肠癌细胞株（LOVO、HCT-8、HT-29、SW-480、DiFi、HCT-116、CaCo2、、LS174T）中SLFN11的mRNA及蛋白表达水平。筛选出SLFN11表达高、低细胞株。（2）脂质体瞬时转染SLFN11siRNA至细胞株，获得低表达SLFN11的体外细胞研究模型。采用Westernblot等技术验证下调SLFN11的效果。（3）转化SLFN11基因至HCT8细胞株。构建pcDNA3.1(+)-SLFN11质粒和EXN91mAb标记的负电荷AuNP载体。设同型mAb标记的AuNP载体做对照，同时使用传统Lipofectamine2000载体做比较，将SLFN11基因导入HCT8细胞。用荧光显微镜观察不同载体介导的SLFN11基因转化率，用Westernblot方法检测转化细胞的SLFN11蛋白表达水平。（4）选取CPT-11的活性代谢产物SN-38对细胞株干预24h或48h。MTT法检测SLFN11siRNA干预或过表达对SN-38抑制人肠癌细胞生存率的影响。（5）PI双染法流式细胞术检测SLFN11基因表达水平对SN-38诱导细胞凋亡率的影响。（6）流式细胞术检测SLFN11基因表达水平对SN-38诱导细胞周期阻滞的影响。结果：（1）SLFN11基因在八种肠癌细胞株中存在差异性表达，该基因的mRNA和蛋白表达水平表现为致。SLFN11在HCT8、HCT116细胞株中表达水平较低，而在LS174T、SW480细胞株中则表达水平较高。（2）SLFN11siRNA有效转染细胞后，与ContolsiRNA组相比，SLFN11基因蛋白表达水平减低50-81%。重组表达质粒pcDNA3.1-SLFN11测序正确。EXN91mAb标记的AuNP载体可将SLFN11基因导入90%以上的HCT8细胞，远远高于Lipofectamine2000载体对SLFN11基因的细胞导入（10%）。而同型对照mAb标记的AuNP载体只有极少量的SLFN11基因导入。经典的Lipofectamine2000载体仅能使HCT-8细胞中SLFN11的蛋白表达水平上调2.1倍，而EXN91-mAb-AuNP靶向输送系统则可使HCT-8细胞中SLFN11蛋白表达水平上调11.9倍。（3）不同浓度SN-38作用肠癌细胞株48h，LS174T和SW480细胞株siRNA干扰组较阴性干扰对照组（mock），细胞生长抑制率明显减低（p<0.01,0.01）。SLFN11低表达的HCT8和HCT116细胞株siRNA干扰组较阴性干扰对照组，细胞生长抑制率无显著性减低（p>0.05）。EXN91mAb-AuNP介导的HCT8细胞SLFN11基因表达上调后，与对照组相比，明显增强SN-38对细胞增殖的抑制（p<0.001）。（4）80nMSN-38作用24h，可诱发肠癌细胞株发生细胞S期早期阻滞，与不用药物空白对照组相比，G0/G1期细胞明显增多，S期细胞明显减少（p<0.01）。SN-38干预LS174T和SW480细胞株中，SLFN11基因siRNA干预均可以明显减少细胞周期S早期阻滞的比例：与mock+SN-38组相比：LS174T和SW480细胞株SLFN11siRNA+SN-38组G0/G1期细胞减少（p<0.05，p<0.05）S期细胞增多（p<0.01，p>0.05）。HCT8细胞株进行EXN91mAb-AuNP介导的SLFN11基因表达上调后，也出现明显的G1期阻滞，G0/G1期细胞比例较对同型mAb照组及空白对照明显升高，S期细胞减少（p均<0.01）。Lipofectamine2000介导的SLFN11基因表达上调后，G0/G1期细胞比例轻度升高，但较空白对照组无统计学差异（p>0.05）。（5）SN-38可以诱发肠癌细胞株凋亡(对照+SN-38组vs空白对照组,p<0.001)。与mockSN-38干预组相比，SLFN11基因siRNA干预可以明显减少LS174T和SW480株用药组细胞凋亡比例（p<0.05，p<0.05）。HCT8细胞株进行EXN91mAb-AuNP介导的SLFN11基因表达上调后，与同型mAb-AuNP对照组相比，SN-38诱导的细胞凋亡比例明显增加（p<0.01）。Lipofectamine2000-SLFN11组较control组，细胞凋亡也有所增加（p<0.05）。（6）SLFN11基因能增强SN-38对细胞的作用，在没有SN-38干预的条件下，SLFN11基因表达水平对细胞周期和细胞凋亡都无影响（p>0.05）。结论：（1）在人源性结直肠癌细胞株中，SLFN11基因表达水平存在明显差异，在LS174T、SW480细胞株中高表达，在HCT8和HCT116细胞株中低表达。（2）SLFN11基因表达水平影响SN-38对肠癌细胞的作用。我们在肠癌细胞株中证实SLFN11表达下调会减低细胞对SN-38的敏感性；上调SLFN11表达可以增强SN-38对肠癌细胞株的生长抑制、细胞周期G1期阻滞和细胞凋亡。（3）我们首次选用EXN91mAb-AuNP作为SLFN11导入细胞的载体，结果显示EXN91-mAb-AuNP可以成为高效的SLFN11基因靶向输送系统，上调SLFN11基因表达。（4）SLFN11可作为预测肠癌CPT-11治疗敏感性的潜在分子标志物，并且有可能成为提高肠癌患者化疗敏感性的潜在治疗靶点。
【作者】田力；
【导师】宋三泰；徐建明；
【作者基本信息】中国人民解放军军事医学科学院，药理学，2014，博士
【关键词】结直肠癌；SLFN11；细胞凋亡；细胞周期；SN-38；

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